Výsledky výzkumu Technické univerzity v Liberci mohou výrazně urychlit monitoring vody zaměřený na odhalení nebezpečných patogenů. Díky metodě založené na qPCR analýze jsou výsledky k dispozici během několika hodin od dodání vzorků do laboratoře.
Sledování patogenu ve vodě je důležitou součástí hygienického hodnocení pitné, teplé i koupací vody (vyhláška 252/2004 Sb. pro pitnou a teplou vodu a vyhláška 238/2011 Sb. pro vodu ke koupání). Patogeny ve vodě zahrnují různé mikroorganismy, které mohou způsobit vážné zdravotní problémy. Mezi nejnebezpečnější patogeny patří bakterie rodu Legionella, které se mohou vyskytovat v teplé vodě a způsobují tzv. legionářskou nemoc. Nebezpečný je také zlatý stafylokok, který může způsobit širokou škálu onemocnění, včetně sepse a syndromu toxického šoku. Podle vyhlášky o teplé a koupací vodě se stanovují patogeny, které mohou zahrnovat legionelly, Escherichia coli, koliformní bakterie, intestinální enterokoky, Clostridium perfringens, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, mykobakterie a somatické kolifágy. Proto se provádí pravidelný mikrobiologický rozbor vody, pomocí tzv. kultivačních metod podle platných ČSN norem a příslušných vyhlášek v platném znění. Výsledky jsou k dispozici během dvou až deseti dnů. Podle zkušeností libereckých hygieniků je doba čekání na výsledek velkým problémem například u poměrně hodně rozšířené legionelly. „Rychlost detekce je klíčová zejména u patogenů, které mohou představovat významné zdravotní riziko, jako jsou například Escherichia coli nebo Legionella pneumophila,“ říká doktorka Magda Nechanická z Oddělení technologie životního prostředí (OTŽP) Ústavu pro nanomateriály, pokročilé technologie a inovace Technické univerzity v Liberci (CXI TUL), autorka nové metodiky, která analýzu podstatným způsobem urychluje. V Libereckém kraji loni legionellu našli téměř v pětině vzorků teplé vody odebraných při 110 kontrolách zdravotnických, sociálních a ubytovacích zařízení, v domácnostech, firmách i koupalištích a saunách. „Testy potvrdily přítomnost patogenních bakterií v 51 z 264 vzorků,“ uvedla Zuzana Balašová, mluvčí Krajské hygienické stanice v Liberci.
Výsledky jsou k dispozici do hodin místo několika dnů
Také liberecká univerzita se v minulých letech opakovaně potýkala s výskytem legionell ve vodě na vysokoškolských kolejích. Výsledky rozboru vody klasickou metodou, kdy bylo potřeba provést kultivaci bakterií na chromogenních médiích v Petriho miskách, byly k dispozici zhruba za deset dnů. Díky nové metodě je možné získat informaci o přítomnosti patogenů do několika hodin od dodání vzorku do laboratoře. To přináší výhodu rychlejší reakce a řešení potenciálních problémů. „Právě rychlost může být zásadní pro přijetí účinných opatření pro ochranu zdraví, protože provozovatelé vodovodních systémů mohou reagovat prakticky okamžitě — například provést dezinfekci, upravit způsob provozování, například zvýšením teploty ohřevu, nebo omezit používání vody ještě předtím, než se problém rozšíří,“ konstatuje Ing. Lenka Lacinová, Ph.D., vedoucí Analytické laboratoře CXI TUL, s tím, že cílem dvouletého projektu Vývoj akreditovaných metodik pro hodnocení kvality vody prostřednictvím molekulárněgenetických metod řešeného na CXI TUL, bylo tuto metodu ve spolupráci s Analytickou laboratoří CXI TUL nechat akreditovat u Českého institutu pro akreditaci. Cíl byl splněn vloni v srpnu, kdy byla tato inovativní metodika úspěšně akreditována pro sedm typů mikroorganismů, a to nejen v různých typech vod, ale i v biofilmech. Jde o koliformní bakterie, Escherichia coli, enterokoky, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, Legionella spp. (včetně L. pneumophila) a Pseudomonas aeruginosa.
Metoda detekuje a identifikuje DNA patogenních mikroorganismů
Metoda, založená na kvantitativní polymerázové řetězové reakci (qPCR analýze — quantitative polymerase chain reaction), umožňuje detekci a identifikaci DNA patogenních mikroorganismů bez potřeby kultivace bakterií v laboratoři. Na CXI TUL využívají qPCR analýzu také k detekci specifických bakterií, například bakterií schopných degradace kontaminantů a (de)nitrifikačních bakterií, a to při monitoringu čištění odpadních vod i při aplikaci sanačních technologií. Používá se také v nemocnicích k analýze vzorků biomateriálu, jako je krev, a umožňuje identifikaci infekčních onemocnění, patogenů a bakteriálních agens. „Rozhodli jsme se využít tuto metodu pro monitoring pitných, teplých a koupacích vod, tedy pro stanovení patogenů, které se stanovují kultivačními metodami. Nejde tedy o objev zcela nové metody. V našem výzkumu jsme vycházeli i z mezinárodních studií, ve kterých už byly tyto bakterie stanoveny. Zkoumali jsme různé postupy a v rámci projektu jsme vyvinuli tuto metodiku, která se dosud pro monitoring pitných, teplých a koupacích vod v České republice nepoužívá. A vzhledem k tomu, že příslušné vyhlášky pro pitnou, teplou a koupací vodu stanovují pouze limity mikrobiologického rozboru vyjádřené jako počet kolonií tvořící jednotku, může metoda qPCR analýzy zatím sloužit jako rychlá doplňková metoda,“ říká doktorka Nechanická. Molekulárněgenetické metody, které prosazuje i pro oblast pitných, teplých a koupacích vod, mohou být podle ní krokem k začlenění moderních technologií do rutinního monitoringu. Výsledky svého výzkumu prezentovala vloni v Litomyšli na konferenci Voda 2025 a získala první místo v soutěži mladých vědců. V letošním roce bude metoda představena například na konferenci Hydroanalytika v září v Hradci Králové. A to jen podtrhuje potenciál této metodiky pro moderní monitoring vody.
Jak se získá DNA patogenů
V klasickém mikrobiologickém rozboru vody jsou použita specifická chromogenní média, pro patogenní bakterie, jako jsou E. coli a stafylokoky. První fáze probíhá u obou metod stejně. „Vzorek vody se odebere na určité lokalitě a zfiltruje se. Pak je už postup odlišný. Mikrobiologický rozbor je založen na kultivaci — tedy růstu — bakterií ve vzorku zachyceném na filtru, položeném na chromogenním agaru. Při námi ověřené inovativní molekulárněgenetické metodě založené na qPCR analýze vložíme filtr se zachycenými bakteriemi do zkumavky, v níž naopak dochází k rozbití (lýze) bakteriálních buněk a následné extrakci a izolaci DNA. Používáme k tomu komerční kit pro izolaci DNA, jehož protokol zahrnuje mechanickou i chemickou lýzu. Součástí kitu je pufr. To je látka, která tlumí výkyvy v acidobazické rovnováze a pomáhá stabilizovat prostředí pro zachování DNA. Následně vkládáme zkoumaný vzorek do homogenizátoru. Dá se říci, že to je typ třepačky, která vzorkem mechanicky velmi silně zatřepe, vzorek se zhomogenizuje a buňky se rozbijí. Následně se pak podle protokolu kitu separuje DNA od přítomných nečistot — to jsou části buněčné stěny, proteiny, RNA a podobně. Když máme izolovanou bakteriální DNA, která tvoří velmi dlouhé úseky, je potřeba zjistit, zda obsahuje určitý gen specifický pro konkrétní patogeny. Pak přichází na řadu qPCR analýza. Ta probíhá v termocykleru, do kterého vkládáme destičku s DNA a reakční směsí. V termocykleru se destička zahřívá v cyklických intervalech, a pokud je ve vzorku DNA přítomen specifický gen, dojde k namnožení tohoto genu a následně díky fluorescenčnímu barvivu, které se vmezeří mezi dvouřetězcovou DNA, se zvýší signál fluorescence,“ popisuje proces Magda Nechanická. Dodává, že se jedná o kvantitativní polymerázovou řetězovou reakci, která umožňuje kvantifikaci DNA v reálném čase. „Samotná reakce je cyklický proces, kdy v rámci cyklu dochází k denaturaci DNA, při které se dvoušroubovice DNA rozpojí (denaturuje) na jednotlivá vlákna. Když je sledovaný gen přítomen, dochází k navázání primerů na úsek sledovaného genu. Posledním krokem cyklu je prodloužení navázaných primerů pomocí DNA polymerázy, čímž vznikají nové komplementární řetězce. To znamená, že jedna kopie sledovaného genu obsažená ve vzorku se v každém následujícím cyklu vždy zdvojnásobí,“ upřesňuje.
Výhody molekulárněgenetických metodik
Další významnou výhodou „liberecké“ molekulárněgenetické metody je kromě rychlosti i to, že se neomezuje pouze na mikroorganismy, které lze kultivovat v laboratoři, ale díky qPCR analýze je možné zachytit i patogeny přítomné v biofilmech nebo ve formách, které běžné metody přehlédnou, a poskytuje tak realističtější obraz o skutečném stavu vodních systémů. Z biofilmů se bakterie získávají stěrem nebo se použije nosič biomasy, umístěný do vodohospodářské stavby, na jehož povrchu se mikroorganismy zachytí a narostou. I tady zabodovali vědci z CXI TUL, konkrétně tým Lukáše Dvořáka, který ve spolupráci s projektovými partnery vyvinul a testoval nosiče biomasy různého charakteru na základě jejich aplikace, například 3D konstrukční textilní pletenou strukturu nosiče biomasy využívající vstupní polymerní multifilament s vysokým specifickým měrným povrchem nebo nanovlákenné nosiče biomasy. Vyšší specifický měrný povrch nosičů vytváří dobré podmínky pro primární uchycení a růst buněk mikroorganismů, včetně zajištění optimálního množství kyslíku a dostatku prostoru pro jejich kolonizaci na nosiči. Dalším přínosem nové metodiky je, že pomocí molekulárně genetických analýz se dá stanovit i DNA z mrtvých buněk, pokud se nerozložila vlivem prostředí. Vysoké množství DNA mrtvých buněk ve vodě může ukazovat na předchozí nebo přetrvávající mikrobiologickou zátěž, například na přítomnost biofilmu v systému, a signalizovat, že je vhodné situaci dále prověřit i klasickými kultivačními metodami. Samotný záchyt DNA z mrtvých buněk však automaticky neznamená bezprostřední zdravotní riziko, proto je důležitá správná interpretace výsledků.
Akreditovaná laboratoř na liberecké univerzitě má desítky zákazníků
Akreditovaná laboratoř je na CXI TUL už od roku 2011. Rozbory vody pro instituce i veřejnost provádí Analytická laboratoř (dříve Laboratoř chemických sanačních procesů) klasickými kultivačními metodami. Jsou to metody přesné a spolehlivé, ale jejich nevýhodou je čas. „Máme přes 30 stálých zákazníků, pro které analyzujeme koupací, pitnou a teplou vodu. Mezi naše zákazníky patří zdravotnická, školská a sociální zařízení, provozovatelé bazénů, lázeňských a wellness provozů, obce, ubytovací zařízení i další subjekty v Libereckém kraji. Naše služby nabízíme také soukromým osobám, které požadují zejména rozbor studniční vody. Rozbory vody jsme dělali například po povodni v Dalešicích. Nová metoda nás může posunou dopředu. Hlavně při podezření na výskyt legionell by rychlé potvrzení pozitivního výsledku umožnilo okamžité řešení problému,“ říká Lenka Lacinová. Vědci CXI metodiku vyvinuli, ověřili a dovedli až do fáze oficiální akreditace. Tím, že Český institut pro akreditaci udělil metodě akreditaci, může Analytická laboratoř CXI TUL jako jediná laboratoř v České republice akreditovaně nabízet metodu pro stanovení souboru sedmi patogenních mikroorganismů pomocí qPCR analýzy. Primárně je nová metoda nabízena k využití pro hygienické stanice, vodohospodáře, správce rozvodů pitné a teplé vody a provozovatele ubytovacích zařízeních. „Může se na nás obracet i široká veřejnost. Naše laboratoř zajišťuje kompletní servis od akreditovaného odběru až po vystavení protokolu s výsledky chemických a mikrobiologických zkoušek, a to i pro nově vyvinuté metody,“ konstatuje doktorka Lacinová.
Dostat se do legislativy
Metoda qPCR analýzy je známá a již se používá například v nemocnicích i laboratořích, ale pro monitoring pitných, teplých a koupacích vod se běžně nepoužívá, protože není uvedena v příslušných vyhláškách. Vloni v Litomyšli na 6. bienální konferenci Voda 2025 CzWA, která se zaměřuje na vodní hospodářství a ochranu životního prostředí, vyvolala prezentace doktorky Nechanické odbornou diskuzi o možnosti prosazení molekulárněgenetických metod do legislativy. „Na tom jsme se shodli i s dalšími specialisty ve vodohospodářství, kteří se molekulární biologií zabývají. My rychle zjistíme přítomnost patogenů. Umíme detekovat gen patogenní bakterie a odhadnout počet jeho kopií, ale výsledky analýzy nejsou vyjádřeny v jednotkách používaných při mikrobiologickém rozboru, tedy jako počet kolonií tvořících jednotku. V tomto případě není možný ani přepočet mezi jednotkami analýz, protože například v případě kolonií nevíme stoprocentně, zda se jedná o kolonii tvořenou jednou buňkou, nebo shlukem buněk. Podstatné je, že zjistíme přítomnost patogenů, protože z hlediska legislativy se jedná o patogeny, které mají ve vodě (například v nemocnicích) nulovou toleranci,“ vysvětluje Magda Nechanická. Podle ní mají molekulárněgenetické metody potenciál stát se důležitou součástí rutinního monitoringu vody. Jejich využití přináší rychlejší identifikaci problémů, účinnější ochranu veřejného zdraví a celkově vyšší bezpečnost vodních zdrojů. Tato metodika tak představuje významný krok směrem k modernizaci vodohospodářské praxe v České republice. „Laboratorně máme metodu ověřenou a akreditovanou ČIA a v současné době s jejími možnostmi seznamuje potenciální zákazníky. Rádi bychom, aby se metody qPCR dostaly nejen do praxe, ale také do českých norem a legislativy, i když si uvědomujeme, že ten proces nebude jednoduchý,“ dodává Lenka Lacinová.
Nová metoda zaujala i hygieniky
Molekulárněgenetická metodika pro monitoring vody zaujala i pracovníky Krajské hygienické stanice (KHS) v Liberci, kde na toto téma liberečtí výzkumníci uspořádali přednášku. Proběhla nejen prezenčně na libereckém pracovišti, ale současně i on-line na všech pracovištích KHS v Libereckém kraji. „Nespornou a velkou výhodou této metody je rychlost, i když to není metoda kvantifikovaná, tudíž nezjistíme, kolik je ve vodě kolonií tvořících jednotku u sledované bakterie, abychom mohli výsledek porovnat s hygienickým limitem. Tato metoda může být velkým přínosem hlavně pro nemocnice a jejich jednotky intenzivní péče nebo anesteziologicko- resuscitační oddělení, kde jsou umístěni imunokompromitovaní pacienti, tedy osoby s oslabenou imunitou, u kterých hrozí závažné a život ohrožující infekce. Na takových odděleních je striktní nulová tolerance těchto patogenů a nesmí tam být skutečně žádné kolonie,“ hodnotí novou metodu ředitelka protiepidemiologického odboru KHS v Liberci MUDr. Monika Hausenblasová. I tam ale, kde je určitá benevolence k výskytu patogenů, je podle ní dobré včas vědět o jejich existenci a okamžitě nastavit účinná opatření. A pokud to je potřeba, tak následně přistoupit k upřesnění množství kolonií klasickou kultivační metodou. „Zdravotnická zařízení, kde provádíme státní zdravotní dozor, můžeme informovat o tom, že je molekulárněgenetická metoda k dispozici, a budeme ji doporučovat z hlediska časové úspory a šanci rychle zjednat nápravu. Co se týče změny legislativního procesu, aby tato metoda byla zahrnuta do legislativy, můžeme tuto změnu podpořit v připomínkovém řízení změny vyhlášky,“ konstatuje Monika Hausenblasová.
/Jaroslava Kočárková/
